Es una colección integrada por alrededor de 8300 volúmenes, es el fondo que perteneció a la Compañía de Jesús antes de su expulsión de América.
Casi la totalidad son impresiones en Europa y van del Siglo XV al XVII, pero existen 8 incunables, el de mayor importancia es De Hystorijs Etatum Mundi ac Descripcióne Urbium , de Schedel Hartmann, impreso en Nüremberg (Alemania), en 1493 y escrito en latín. Trata sobre la cronología histórica e historia universal desde la creación del universo, bajo la teoría creacionista (teología).
De esta colección también es el libro más antiguo que posee la Biblioteca, se trata de Sermones aurei de sanctis fratris , escrito en 1.480 por Leonardus de Utino,
No podemos dejar de incluir otro de los tesoros que alberga la Biblioteca Nacional, que es el manuscrito La Floresta Americana , del sabio francés Aimé Bondpland, escrito aproximadamente en 1850.
Este manuscrito inédito contiene 122 láminas con dibujos de la flora paraguaya y latinoamericana con los nombres de las especies en latín, francés y guaraní.
Por su importancia ha sido reconocido e inscrito por la UNESCO en el Registro Regional de la Memoria del Mundo.
